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ビデオを読み込めません. バクテリオシンは異なる生態学的ニッチで微生物の多様性を定義する上で重要な役割を果たすと考えられている. ここでは、バクテリオシンが動物モデルにおける腸内微生物の組成にどのように影響するかを評価するための効率的な手順を説明します. 腸内微生物の組成と健康との関係、特に人口バランスの維持に寄与する要因に関する私たちの進歩的な知識では、非常に興味深い疑問が生じます. バクテリオシンは、多くの細菌によって産生され、食物の獲得および/またはニッチの確立のための競争上の利点をもたらす抗菌ペプチドである. 多くのプロバイオティクス乳酸菌（LAB）株は、病原体の増殖を防止することにより、ヒトおよび動物の健康を促進する大きな可能性を秘めています. それらは、バクテリオシンを産生するので、免疫調節のためにも使用することができる. しかしながら、バクテリオシンの拮抗活性は、細菌が宿主および多数の微生物種が同じニッチを共有する多因子的影響に直面するヒトおよび動物の複雑な腸環境と比較して、明確ではあるが単純化された条件下で実験室バイオアッセイによって通常決定される. この研究は、ネズミ系において異なる標的特異性を有する様々なバクテリオシンの効果を評価する完全で効率的な手順を記載している. 本発明者らのアプローチは、バクテリオシン生産体およびそれらの同遺伝子性非バクテリオシン産生変異体の両方を使用し、後者は、バクテリオシン関連を微生物の非バクテリオシン関連修飾と区別する能力を与える.
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糞便DNA抽出法と16S rDNAシーケンシング法は一貫しており、バイオインフォマティクスとともに、細菌のプロファイルの微妙な変化を発見し、細菌集団と健康マーカーの間のコレステロールおよびトリグリセリド濃度に関して相関関係を確立する強力な手順を構成する. 私たちのプロトコールは一般的なもので、毒性や有益な効果を研究する際に宿主微生物の組成を変える可能性のある他の化合物や栄養素を研究するために使用することができます. バクテリオシンは、広範囲の細菌種1,2によって産生される抗菌ペプチドである. これらの化合物およびそれらの生産者、特にLABは、食品保存および医学における潜在的な応用のために、世界中で数十年にわたり探索され、利用されている3. いくつかのバクテリオシンは、Listeria、Enterococcus、Staphylococcus、およびBacillusの種を含む重要な病原体を殺すことが知られている. 多くのバクテリオシンは、比較的狭いスペクトルを有し、いくつかの用途において非常に評価される特性を有する. 例えば、いくつかの狭スペクトルバクテリオシンは、同じニッチを共有する共生または有益なフローラに大きな障害を与えることなく、問題のある細菌の選択されたグループに対して特異的な活性を導くために使用することができる。これは、多くの有益な微生物が相互作用的かつ動的な方法で繁栄する腸環境において特に重要である5. バクテリオシンはまた、病原体、病原体、または腸内ホメオスタシスの不均衡を引き起こす可能性のある日和見細菌の増殖を抑制することができるため、予防的またはプロバイオティックな使用に非常に魅力的です6,7.
それらの性質および物理化学的特性の点で、バクテリオシンは、それらが異なる構造、標的特異性、作用様式などを有するので、非常に多様である. ほとんどのバクテリオシンはin vitro環境で非常に詳細に研究されていますが、食品マトリックスや動物実験ではほとんど検出されていません8,9. インビトロ特性は、腸環境の複雑さおよび有益な細菌に対する推定されない意図されていない効果のためにインビボで評価した場合に大きく異なる可能性がある. それらは宿主の生理に影響を与えることが知られている短鎖脂肪酸を含む他の代謝産物の配列を産生するだけでなく、特定の細菌に対する抗菌特性を示す.
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したがって、バクテリオシンを産生するプロバイオティック株の場合、正常な微生物叢を有する健康な動物のような現実的なアッセイを確立することが最善である.
本研究では、異なる阻害性スペクトルを有する異なるバクテリオシン産生株の健康なマウスへの影響の評価を可能にする戦略を提供する. 我々の戦略には、バクテリオシン媒介性の影響を非バクテリオシン媒介性の効果と区別することを可能にする、同種異系の非バクテリオシン変異体をマウスに与えることが含まれる. その後の統計的分析は、細菌種間および細菌種と測定された生理学的パラメータ間の相関を解読する（e. この研究で提示されたプロトコールは、生きた動物におけるバクテリオシンの研究を超えて、他のプロバイオティックまたはプレバイオティクスの用途にも適用可能であると考えられる. ここに記載されている手順は、欧州連合法および2010/63 / EUおよびスペイン政府の動物保護に関するRD 53/2013によって義務付けられている実験動物管理の原則に従って、バレンシア大学および地方当局の対応する倫理委員会によって承認された動物実験における3R原則を尊重するために、科学的目的のために使用される（置換、縮小、精密化）. マウスに接種するために使用される凍結細菌培養物
脳心臓注入（BHI）培地5mLにLABの個々の株を接種し、30℃で20〜24時間（一晩）培養する. 2mLの終夜培養物を200mLのBHIに移すことにより、BHI中で各一晩の細菌培養物を100倍に希釈する. 上清を除去し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）100mLに各細胞ペレットを懸濁させ、ステップ1のように細胞を回収することにより細胞を2回洗浄する. 保存前および投与前の細胞数を決定し、マウスに与えられた生存細胞の数が分かるようにする. 細胞増殖およびコロニー形成のために30℃で一晩（20〜24時間）インキュベートし、コロニー形成単位（cfu）/ mLを決定するために後者をインキュベートする. バクテリア含有飲料水を作るには、最終的に平均109 cfu / mLの水を滅菌濾過した飲料水100 mL中の各細菌ストック培養液の細胞を希釈する. 細菌生存評価のために、細菌処理の最初の2週間の間に、希釈直後および24時間後に生きた細胞を週に1回カウントする. マウスアッセイと実験デザイン
注：この実験には、特定病原体不使用（SPF）BALB / c若い雌マウス（6〜8週間）が必要です。ここでは、合計100匹の動物を購入した. 各治療に独自のコントロールがある場合は、対になるケースコントロールデザイン（t-テスト）を適用し、.
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予備アッセイを使用して、決定される最も重要な影響の平均および標準誤差を計算する. さまざまな方法と自由に利用できるプログラムを使用して、アッセイの力とグループごとに必要な動物の数を最適化する11. バクテリオシン生産株対非生産株の効果を試験するために、実験条件当たり9匹の動物を使用する. 10個のケージは、5個のバチロシン産生株および対応する5個の同質遺伝子非産生株による処理に対応した。第11のケージは10匹のマウスを有し、未処理対照を構成した. 飼育施設へのマウスの到着後、それらを檻に入れて耳に入れて、動物に個別に追跡させる. 各ケージ内のマウスが同じ水ボトルを共有するように明確に識別された対応する独立したケージに飲料水ボトルを配置する. 注：対照群は、試験された細菌と接触しない別個のケージ内に保管しなければならない. 毎日新鮮な飲料水（100 mL）で新しいボトルを準備し、新しく解凍したバクテリア懸濁液を加える. 2週間の期間、バクテリアの処理に従います。その間、マウスは無菌水を飲みます（図1）. 注：時々、マウスの尾を上に保持するだけで十分です。便は肛門から直接チューブに集められます. 多くの糞便サンプルが実験中に収集されるので、事前に計画し、十分な貯蔵ボックスを提供する. 細菌投与の最後の日である15日目にすべてのマウスの顔面静脈から血液サンプルを採取し、血液中のトリグリセリド、総コレステロール、高密度リポタンパク質（HDL）、および低密度リポタンパク質（LDL）のレベルを測定する血清. 注：経験豊富なスタッフは、動物のストレスを軽減するために血液を収集する必要があります. 糞便懸濁液をホモジナイズし、氷冷0で10倍連続希釈物を調製するための5mLチューブ. 予め温めたマン・ロゴサ・シャープ（MRS）軟寒天（50℃、0℃）4mLに希釈細胞（100L）. 滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させた後、細胞を20〜24時間30℃でインキュベートして細胞増殖およびコロニー形成を行う.
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バクテリオシン生産者の希釈細胞（100L）を4mLの予熱したMRS軟寒天（50℃、0. 注：この層は、細胞が寒天プレートの表面にコロニーとして増殖するのを防ぐことを目的としています. インジケータ細胞を上に注ぐと、表面上で増殖する細胞は容易に移動する（ステップ4. 細胞増殖およびコロニー形成のために30℃で20〜24時間インキュベートする前に、滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させる。. バクテリオシン産生コロニーを同定するために、表1に示すように、適切なインジケーター株の一晩培養物40Lを、予め加温した軟寒天. 細胞増殖およびコロニー形成のために30℃で20〜24時間インキュベートする前に、滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させる。. 注：バクテリオシン産生コロニーはコロニーの周りに明確な（阻害）ゾーンを持っています（図2）. DNA抽出、16S rDNA増幅、シークエンシング
注：DNA抽出のステップは、市販のキット（e.
300μLの溶解溶液中に1〜2個の糞便マウスペレット（約200mg）を懸濁する。. 10U / Lのムタノリシン1Lおよび20mg / mLのリゾチーム2Lを各サンプルに添加し、37℃で40〜60分間インキュベートする. 上清に浮遊している粒子があれば、氷上で5分間インキュベートした後、再び遠心分離してください. 16,000×gで1分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを約15分間乾燥させる.
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ペレットが乾燥したら、100Lの滅菌水またはTris（10mM）/ EDTA（1mM）緩衝液を添加し、ペレットを再懸濁する. 2倍量（200L）の緩衝液NTIで抽出したDNAを混合して、工程5の結合条件を調整する。. PCRクリーンアップカラムを含むシリカメンブレンをコレクションチューブ（2 mL）に入れ、サンプルをロードします. シリカ膜を11,000×gで1分間遠心分離して乾燥させ、残留エタノール含有洗浄緩衝液NT3を除去する. 5mLのマイクロチューブに入れ、70℃で2〜5分間インキュベートしてエタノールを完全に除去する. それぞれの時点で同じケージを共有するマウスからのDNAサンプルを標準化しプールする. 時間の間の個々の変動を観察するために、0日目、14日目および28日目に、コントロールおよび2つの他のランダムなケージからランダムに選択した3匹のマウスからのDNAサンプルを配列決定する. 16S rRNA遺伝子の増幅とシークエンシング
増幅された16S rRNA遺伝子のライブラリーを調製する. 適切なオーバーハングアダプターを有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅する：5 '-TCG TCG GCG GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGNGGC WGC AG-3' 5 '-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3' 1％アガロースゲル電気泳動を用いて増幅したバンドをチェックする. アンプリコン精製のために磁気ビーズを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物をクリーンアップする. 使用した大規模シーケンシングプラットフォームに従って製造業者が指示するように、以下のステップを実行する6. 機器に付属のソフトウェアを使用して生の読み取りデータとデマルチプレックスをフィルタリングする. USEARCH14（バージョン7）で実装されたUPARSEパイプライン13を使用して、ペアエンドの読み取りを処理します.
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ペアの端をマージし、最大期待誤差（maxee）値1を使用して品質フィルタリングを適用します. 配列を97％の配列同一性で操作分類学的単位（OTU）に分類し、UCHIME15を使用してキメラ配列をフィルターする. OTUピッキング、分類学的割り当ておよび系統発生的再構成、多様性分析および視覚化. PyNAST18を使用して、少なくとも75％のID（デフォルト）を使用して、代表的なOTUをGreengenesコアセットdatabase17に対して選択して整列させます。. リボソームデータベースプロジェクト（RDP）分類プログラム19を使用して、整列した配列にタクソノミーを割り当て、信頼度0. OTUテーブルを、最小シーケンス深度を有するサンプルのシーケンスカウントに正規化する. 高度に可変な領域およびすべてのギャップである位置を除去するために、濾過ステップ後にFast Tree20を使用して整列した配列から系統樹を構築する. このツリーを使用して、アルファとベータの多様性を計算し、希薄化曲線とシャノンインデックスを計算する. Unweighted UniFrac distance metrics21を生成して可視化するには、主座標分析（PCoA）を使用して、. 注：統計解析のために、R22やQIIME16で実装された統計ツールなど、さまざまなソフトウェアパッケージを使用することができます. 異なる治療間の多様性のシャノン指数の比較のために、時間をRの連続従属変数として考慮するANCOVAを使用する. ボンフェローニ補正（Bonferroni correction）を用いて、両面スチューデントのt検定を使用してQIIMEのPCoAにおける治療間の距離を比較し、1,000モンテカルロ置換を用いてノンパラメトリックなp-値を計算する. 特定のOTUの相対存在量と、コレステロール、HDL、LDLなどの血清レベルなどの他の測定パラメータとの間の相関関係を分析する. この目的のために、CoNet23を、Cytoscape 3を使用した相関ネットワークのその後の視覚化とともに使用します. バクテリオシンの生産は、日和見バクテリアおよび病原体の増殖を防止すると考えられていたので、LABの陽性プロバイオティック特徴と考えられている.
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この研究の目的は、マウスモデルにおける腸内細菌叢集団を調節するバクテリオシンの能力を示すことであった. この目的のために、バクテリオシン産生株とそれらの同系非産生株の摂取の効果を比較するための手順が開発された. マウスを11個のケージにグループ分けした：処置なしのコントロール、バクテリオシン - プロデューサー株で処理した5ケージ、およびバクテリオシン産生を減少させたまたは欠損した対応する同遺伝子突然変異体で処理した5ケージ. 試験したバクテリオシン産生LABならびに飲料水中の各カウント（cfu / mL）および糞中のカウントを表1に要約する. すべてのサンプルおよびすべての細菌群を一緒に考えた場合、バクテリオシン処理と同起源株との間に有意差はなかった（図3）. しかしながら、図4に示すように、特定の細菌属を独立して研究した場合には、おそらく違いがあった. さらに、Pearsonの相関分析は、図5のCoNetに構築されたネットワークによって示されるように、異なる細菌属と細菌属とトリグリセリドおよび血清中のLDLとの間の相関性の間の有意な連関を明らかにした.
図2：3層プロトコルによる糞便から回収されたLAB中のバクテリオシン産生の検出（手順に記載）. PCoAプロットは、重み付けされていないUniFrac行列の計算された距離に基づいて生成された. この図を分かりやすくするために、ガルビシンおよびサカシン産生株および非生産株（図中の色および治療に関する伝説を参照）. サンプルの時間は、T0（接種前）、7日（7日）、14日（14日）、21日（21日）および28日（28日）.
図4：治療期間および治療期間中の属レベルでのLABおよびバクテリオシン標的細菌群の相対的存在度の変化. 時間0に関して得られた治療における属の相対存在量の変化を対照群（CON）のものと比較し、. この図を分かりやすくするために、ガルビシンおよびサカシン産生株および非生産株（図中の色および治療に関する伝説を参照）.
図5：14日目および血清レベルにおけるOTUの相対的存在量の相関ネットワーク. 異なる家族に属するOTUは異なる色で表されるが、有意なもの（P Chol）、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）およびトリグリセリド（Trigは1色（灰色）伝説を参照してください）.
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18エンテロコッカス・フェシウムP21（LMG 2783）ラクトバチルス・サケイB1501（sakA - ）2. 05 Pediocccus acidilactici B1502（ped ）26 9匹のマウス8匹. 12 Enterococcus faecium P21（LMG 2783）Pediocccus acidilactici B1503（ped - ）25 9マウス8. 09 Enterococcus faecium B1504（L50 wt ）6 9マウス8. 14 Pediococcus damnosus（LMG 3397）Enterococcus faecium B1505（L50硬化 - ）10 9マウス8. 14ラクトバチルスプランタラムB1507（planta ）26 9 9マウス9. 965（LMG 2003）Lactobacillus plantarum B1508（planta - ）23 9マウス8. 08ラクトコッカス・ラクティスIL1403（LMG2705）ラクトコッカス・ガルビエB1516（GarML-）17 9マウス8. 18腸球菌（Enterococcus faecium）P21（LMG 2783）はSakA、PedPA-1、Pediococcus damnosus（LMG 3397）はエンテロシン、Lactobacillus spp. 965（LMG 2003）、GarML用ラクトコッカス・ラクティスIL1403（LMG2705）. ここに記載された手順は、微生物の変化が健康状態または年齢に結びついているかどうかを判断するために用いられている. プロトコルのさまざまな部分が重要ですが、それらの中で、糞便のサンプリング、配列決定および分析されるべきDNA断片の選択、およびDNA抽出およびバイオインフォマティクス分析の実行は、確かに最も重要な点です.
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倫理的理由から、マウスにストレスを与えてはならないし、腸内の細菌の割合を変化させることが知られているので、サンプリングが重要である. サンプルはできるだけ早く処理しなければならないか、使用するまで凍結する必要があります。一部の細菌は脱水や酸素に非常に敏感です. 増幅された16S rRNA遺伝子から配列決定されるべきDNA断片の選択は重要な点である. 試料中に存在する細菌細胞は、全て異なる溶解プロトコールに等しく感受性であるわけではないので、DNA抽出法の重要性を過小評価してはならない。細菌集団の推定における偏りは、不完全な溶解. 菌株の場合には、形質転換染色体コード化バクテリオシンに不応性であることが問題を示すかもしれないが、同遺伝子株は遺伝子ノックダウンまたはプラスミドキュレーションによって構築することができる.
この手順は、研究される因子の変化のタイプに応じて、ほとんどのステップで変更することができます. 接種手順は短縮される可能性がありますが、血清パラメータの変更には時間がかかることがあります. この方法の可能性のある制限は、水中で数時間生き残ることができないか、または化合物のために凝集し得る（または化合物のために沈殿する）細菌株（栄養素または化合物）.
今まで、バクテリオシン活性は、一般にインビトロで27,28,29または混合培養物30で決定された. この方法は、標準実験室マウスの全腸微生物叢からの5つのバクテリオシンの活性のin vivoモニタリングを可能にしている. 集団のわずかな変動だけでなく、血清パラメータなどの他の細菌群または生理学的因子への影響も決定することができた12. バクテリオシンは、比較的狭い活性スペクトルを有し、分類学上関連する細菌の増殖を阻害する. しかし、このアッセイで使用されるものは、サッカシンA32の場合のように、黄色ブドウ球菌、リステリアモノサイトゲネス31、および大腸菌のいくつかの株でさえも活性があるので、最も効果的である.
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マウスに接種した場合、LAB産生バクテリオシンは、全体的な微生物の組成に顕著な変化を生じなかったが、減少した細菌分類群. それにもかかわらず、世界的な相関ネットワーク分析は、異なる細菌間の興味深い生態学的相容性および拮抗作用を明らかにした. この方法は、健康状態を保つために予期された結果が意図的に制限されるかもしれないが、食品成分、薬物、または他の化合物の影響を分析するために適合させることができる. 著者らは、EEAグラントNILS科学者と研究者の持続可能性の調整された移動性（参考文献017-ABEL-CM-2013）に感謝し、. ノルウェー生命科学大学（NMBU）からの食品科学研究のための戦略的奨学金プログラム（プロジェクト1205051025）によって支援され、. 我々はまた、動物のケアとサンプリングに関する彼女の支援のためにInmaculada Nogueraに感謝し、動物施設における実験材料の利用可能性を保証する彼の助けを借りてJesus Dehesaに感謝したい. 名前会社カタログ番号コメントBalb / cマウス（女性）Harlanマウスは6〜8週齢でなければならないプラスチックペトリ皿Thermo Scientific 101VR20 Brain-Heart-Infusion broth Conda 1400. 00 1x TAE緩衝液サーモサイエンティフィック15558042 MRSブロスDifco 288130 PBS錠Sigma P4417-100TABスケールMettler Toledo PB602-S無菌鉗子Levantina de Laboratorios S. 260-3710014微量遠心機エッペンドルフ5424遠心分離機Hermle Z383K塩化ナトリウムAppliChem Panreac 121659. 1211 Realpure SSSキットReal Life Science Solutions、Durviz、スペインRBME04（300 ml）イソプロパノール適用例Panreac 131090. 1214 Qubit蛍光光度計Invitrogen Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q3285 AMPure XPビーズBeckman Coulter Genomics、米国A63881 PerfeCta NGSライブラリー定量キットQuanta BioSciences、Maryland、USA 733-2300 MiSeq v3試薬キットIllumina、San Diego、California、USA MS-102-3003 16S rRNA遺伝子増幅のためのプライマープライマーには、細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域とイルミナオーバーハングアダプターが含まれています：5-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3および5＆apos; ; - GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 Nextera XTインデックスキットFC-131-1002インデックスおよびイルミナシーケンシングアダプターマイクロペストル1. 直径1 mmのBiospec製品11079-101 NucleoSpinゲルおよびPCRクリーンアップキットMacherey-Nagel 740609. 19-040 mutanolysin Sigma M9901-10KUリゾチームRoche 10837059001 proteinase K Roche 3115887001 RNase A Sigma R4875ダウンロード資料リストPapagianni、M. バクテリオシン生産：プロバイオティック特性？ Appl Environ Microb. バンコマイシン耐性腸球菌による腸内コロニー形成を減少させるヒトNisinおよびPediocin産生乳酸菌の能力. バクテリオシンは抗生物質の実行可能な代替物ですか？ Nat Rev Microb.
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エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）RZS C5は、食品発酵における共培養として使用される興味深いバクテリオシン生産体である.
低酸発酵ソーセージに接種された食物媒介性病原体を制御するためのエンテロシンAS-48と高静水圧の複合効果. ラクトバチルスサリバリウスバクテリオシンAbp118のマウスおよびブタの腸内微生物に対する影響. 動物実験でサンプルサイズを計算するには？ J Pharmacol Pharmacother. QIIMEは、ハイスループットのコミュニティシーケンシングデータの解析を可能にします. Greengenes、キメラチェック16S rRNA遺伝子データベースとARBに対応したワークベンチ. Cytoscape：生体分子相互作用ネットワークの統合モデルのためのソフトウェア環境. 古典的および次世代配列決定ベースの多様性研究のための一般的な16SリボソームRNA遺伝子PCRプライマーの評価. 野菜培養液中の乳酸菌による増殖とバクテリオシン生産とListeria monocytogenes in vitroおよび新鮮レタス還元効果. 特定の細菌との共培養は、オリーブ発酵におけるオートインダクター調節バクテリオシン生産体であるラクトバチルスプランタラムNC8の生存を促進する. 伝統的な中国発酵キャベツから単離されたラクトバチルス・サケC2により産生される広範な阻害スペクトルを有する新規なバクテリオシン.
